Plateau d’Imagerie Cellulaire et Cytométrie (PIC2)
Le plateau PIC2 propose des services d’analyse cellulaire axés autour de deux techniques :
1/ La cytométrie en flux et tri cellulaire à haut débit.
- Responsable: Stefania Tolu (stefania.tolu@u-paris.fr)
2/ La microscopie à fluorescence par onde évanescente (TIRFM)
- Responsable: Cécile Tourrel-Cuzin (cecile.tourrel-cuzin@u-paris.fr)
Le plateau est une structure ouverte à tous les personnels appartenant aux équipes de recherche de BFA mais également aux unités de recherche extérieures et aux entreprises privées.
La Cytométrie en flux et le tri cellulaire
PRINCIPES
La cytométrie en flux est une technique qui permet d’effectuer une analyse quantitative à grande vitesse d’une composition de particules complexes (cellules, bactéries, parasites, billes…) sur la base des caractéristiques individuelles telles que la taille, la forme et la granulosité et de leur fluorescence. Les particules en suspension passent une à une devant un ou plusieurs faisceau (x) laser (point d’interrogation) et des détecteurs captent les signaux émis par chaque particule, tels que :
- La lumière diffusée aux petits angles (Forward Scatter, FSC) qui renseigne sur la taille des particules.
- La lumière diffusée à 90 degrés (Side Scatter – SSC) qui renseigne sur la forme, la structure interne et la granulosité des particules.
- Les signaux de fluorescence (autofluorescence et fluorescence par marquage avec anticorps ou sonde spécifique).
Le tri cellulaire peut être défini comme la séparation physique de cellules ou de particules d’intérêt à partir d’une population hétérogène par déflection électrostatique des gouttes chargées. Les cellules sont injectées en flux unique par une buse dans un courant continu (jet). Le jet est rompu grâce à l’application d’une vibration pour donner des gouttes à un point précis appelé « Break-off point ». Les gouttes sont chargées électriquement, passent entre deux plaques de déflection fortement chargées et sont déviées du côté de la plaque de polarité opposée pour être enfin collectées.
EQUIPEMENT
Le plateau est équipé d’un FACS Aria II (BD Biosciences), qui comporte :
➤ une chambre d’injection à température ajustable (4, 20, 37 ou 42°C)
➤ 2 lasers d’excitation, qui permettent de détecter jusqu’à 9 paramètres
• Laser Bleu (488 nm) : 6 détecteurs (5 fluorochromes + granulosité)
• Laser Rouge (633 nm) : 2 détecteurs
➤ 5 buses (70, 85, 100, 130 µm): tri de cellules de différentes tailles
➤ un module de tri en tube de 1 à 4 populations cellulaires
➤ un module de tri de clones cellulaires individuels (module ACDU), dans des puits de plaque (24, 96, ou 384 puits) ou encore sur lame de verre.
➤ un logiciel d’acquisition FACSDiVa™qui permet le pilotage et les réglages de l’appareil et l’acquisition des données.
APPLICATIONS
La cytométrie permet d’effectuer différentes analyses cellulaires telles que :
1/ l’analyse des constituants cellulaires (ADN, ARN,Protéines, Phénotypage…)
2/ l’analyse de fonctions cellulaires (Flux ioniques, modification de pH, Apoptose, activité enzymatique…)
3/ l’analyse de cellules transfectées (EGFP, PE, APC…)
Toutes ces mesures peuvent être associées entre elles et dans certains cas accompagnées d’un tri cellulaire.
La microscopie à fluorescence par onde évanescente (TIRFM)
PRINCIPES
La microscopie TIRF (pour Total Internal Reflection Fluorescence), ou microscopie à champ évanescent, est une forme de microscopie en fluorescence où la lumière d’excitation est confinée à une petite zone au niveau de l’interface entre l’échantillon et la lamelle en verre ou la cuve de culture.
De nombreux processus cellulaires font intervenir la membrane plasmique des cellules : la formation et la stabilisation de zones d’adhérence, le trafic de récepteurs membranaires, la fusion de vésicules ou leur bourgeonnement, ou encore le recrutement de protéines sur la membrane plasmique. L’étude de ces phénomènes en microscopie TIRF permet une observation avec une bonne résolution axiale, ainsi qu’avec une vitesse d’acquisition et de limitation de la cytotoxicité de l’illumination.
Lorsqu’un faisceau de lumière polarisée monochromatique (laser) illumine une interface entre deux milieux d’indice de réfraction différent (par exemple, l’interface entre une lamelle de verre et une cellule), une partie de la lumière incidente est réfléchie sur l’interface et l’autre partie de la lumière est réfractée à travers la surface (A). Selon l’angle d’incidence du faisceau toute la lumière peut être réfléchie. En condition de réflexion totale, une des composantes électromagnétiques de la lumière, l’onde évanescente, se propage perpendiculairement à l’interface avec une intensité qui décroît exponentiellement avec la distance à l’interface (B).
EQUIPEMENT
Le plateau dispose d’un montage NIKON installé sur un microscope inversé à fluorescence (Ti-Eclipse). Le microscope possède une chambre thermostatée (Life Imaging Series) permettant de conserver les échantillons dans des conditions physiologiques.
Ce système est équipé de :
- Deux lasers 50mW Cobolt SLM (Single-Longitudinal Mode) permettant d’exciter la fluorescence à 488 nm et 560 nm
- Deux cubes de Fluorescence, une cube FITC (Excitation 488/10 nm ; Miroir dichroïque : 505 nm ; Emission : 525/50 nm) et un cube TRITC (Excitation : 568/10 nm ; Miroir dichroïque : 565 nm ; Emission : 610/60 nm
- Un Miroir dichroïque multibande
- Deux objectifs : un CFI Achromat LWD ADL 20X et un CFI Apochromat 60X TIRF O.N. 1.49 à huile permettant une réflexion totale du faisceau laser.
- Une caméra Photometrics EMCCD QuantEM 512SC (512×512 pixels; Roper Scientific)
- Un logiciel de pilotage et d’acquisition MetaMorph version 7.5 (Molecular Devices).
APPLICATIONS
La microscopie de fluorescence TIRF permet d’effectuer les analyses suivantes:
- Visualisation des zones de contact, d’adhérence des cellules sur un substrat.
- Visualisation de molécules uniques proches de la surface membranaire : diffusion dans la membrane, interactions protéines/protéines, agrégations…
- Mesure des constantes de vitesse de fixation de protéines sur des récepteurs membranaires ou d’adsorption sur une surface.
- Suivi de granules de sécrétion sur cellules vivantes, études des mécanismes d’endocytose et d’exocytose.
- Visualisation de la morphologie et la dynamique du cytosquelette.
Conditions d’utilisation
DU CYTOMETRE et TRIEUR DE CELLULES
📍Accès
- Bâtiment Buffon A, 5ème étage, pièce 532 A
📅 Demande de RDV
- par mail à stefania.tolu@u-paris.fr (après étude de faisabilité)
💰 Tarifs des prestations
- Tarification à la demi-heure pour l’analyse et à l’heure pour le tri.
| Tarifs horaires (€) | Analyse | Tri |
| Unité BFA | 30€ | 50€ |
| Laboratoires UPC, CNRS | 33€ | 55€ |
| Laboratoires Publics | 42€ | 60€ |
| Laboratoires Privés | 80€ | 170€ |
📓Publications et communications
- Afin d’assurer une visibilité au plateau technique, les utilisateurs doivent citer le plateau dans les remerciements des publications incluant des résultats obtenus sur le cytomètre.
DU MICROSCOPE TIRF
📍Accès
- Bâtiment Buffon A, 5ème étage, pièce 532 A
📅 Demande de RDV
-
par mail à cecile.tourrel-cuzin@u-paris.fr (après étude de faisabilité)
📓 Publications et Communications
- Afin d’assurer une visibilité au plateau technique, les utilisateurs doivent citer le plateau dans les remerciements des publications incluant des résultats obtenus sur le TIRF